ELISA的基本原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顧名思義就是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為
基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。因此，一個(gè)ELISA測(cè)定試劑，其有機(jī)組成部分包括三個(gè)方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物等?？乖蚩贵w的固相化并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過程而喪失。整個(gè)測(cè)定中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來完成測(cè)定。
固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)
固相上抗原抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間 通常，固相免疫測(cè)定如ELISA中抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，要大于液相免疫測(cè)定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孑L板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴性，擴(kuò)散性越強(qiáng)則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。這一點(diǎn)可通過旋轉(zhuǎn)振蕩來達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來做到這一點(diǎn)。微顆粒小于lum時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆?；蛑檩^大時(shí)，則會(huì)在沒有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測(cè)定的擴(kuò)散依賴性。
反應(yīng)體積 此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測(cè)定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測(cè)定，但比反應(yīng)管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體—固相界面，可能處于一級(jí)結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于10nm。液相中待測(cè)抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。這也是全自動(dòng)化免疫測(cè)定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積，這無法計(jì)算。這一點(diǎn)使得使用通常的質(zhì)量作用定律圖形的Keq的計(jì)算變得復(fù)雜化，因此，固相抗原抗體反應(yīng)的KeQ值與液相抗原抗體反應(yīng)的Keq值沒有可比性。
微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定 使用吸附的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，
與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體—配體相互作用的穩(wěn)定性似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾
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