熒光PCR法，全稱為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time Fluorescent Quantitative PCR)，是一種在DNA擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化的技術(shù)。
熒光PCR法的基本工作原理：
1.引物設(shè)計(jì)與特異性結(jié)合：實(shí)驗(yàn)人員需設(shè)計(jì)一對(duì)與待測(cè)DNA模板序列兩端互補(bǔ)的特定引物，確保其僅與目標(biāo)序列結(jié)合，避免非特異性擴(kuò)增。
2.熒光標(biāo)記探針或染料的應(yīng)用
-TaqMan探針法：探針與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，且攜帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。在PCR延伸階段，DNA聚合酶的外切酶活性將探針?biāo)?，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào)。
-SYBR Green I染料法：SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的染料，具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)。在游離狀態(tài)下,SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光,但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,熒光信號(hào)會(huì)大大增強(qiáng)。因此,SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān),可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系中的雙鏈DNA數(shù)量。
3.擴(kuò)增過程與熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)：PCR反應(yīng)遵循變性、退火、延伸的循環(huán)規(guī)律。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，儀器通過激光激發(fā)熒光基團(tuán)，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，并記錄達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)。Ct值與起始模板拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算待測(cè)樣本的初始DNA量。
4.數(shù)據(jù)分析與定量：利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣本的Ct值代入曲線方程，即可推算出原始模板的拷貝數(shù)。此方法實(shí)現(xiàn)了從定性到準(zhǔn)確定量的跨越。
熒光PCR法的使用方法：
1.定期校準(zhǔn)：確保儀器在使用前經(jīng)過定期的校準(zhǔn)和驗(yàn)證，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
2.清潔光學(xué)系統(tǒng)和樣品倉(cāng)：定期清潔光學(xué)系統(tǒng)和樣品倉(cāng)，保持設(shè)備內(nèi)部清潔，避免污染影響測(cè)量精度。
3.檢查反應(yīng)板：確保反應(yīng)板無損壞且孔位正確，以避免影響反應(yīng)效率。
4.日常維護(hù)：每次實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)及時(shí)清理儀器表面的污漬和殘留物，并對(duì)關(guān)鍵部件進(jìn)行消毒處理。同時(shí)，定期對(duì)儀器進(jìn)行檢查和維護(hù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決潛在問題。
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